结论

  本研究以枯草芽孢杆菌谷氨酸到脯氨酸代谢途径中glnA、proB、proA基因为研究对象，通过分子改造分别构建了重组菌WB601-WB604，摇瓶发酵检测各重组菌的胞外和胞内游离脯氨酸积累情况，以此探究途径中相关基因的功能以及对渗透压调节因子脯氨酸合成的影响。

  结果显示，在非胁迫条件下，proB、proA基因的过表达能显著提高细胞合成脯氨酸的能力，说明proB、proA基因的过表达增强了脯氨酸合成途径。但是过表达proB、proA会对菌体生长造成负担，而过表达proA对生长的影响更大，进而可能影响了其胞外脯氨酸的积累；glnA基因的缺失同样能增强细胞合成脯氨酸的能力，表明敲除glnA基因阻断了脯氨酸代谢途径中前体谷氨酸的分解途径，从而加强了脯氨酸合成途径。此外，相比于单独敲除glnA基因，在glnA基因缺失的基础上过表达proB基因使得重组菌脯氨酸的合成能力进一步提升。这表明，以上2个关键节点的同时改造可对细胞合成脯氨酸的能力产生正向协同作用。

  在盐离子胁迫条件下，实验菌株生长均受到不同程度的胁迫，而胞内游离脯氨酸含量均高于非胁迫条件下，并达到相对平衡的状态，这说明在盐离子胁迫条件下，细胞内的游离脯氨酸浓度会上升并达到相对平衡状态从而应对高渗环境。此外，重组菌WB601、WB602和WB604的菌体量均高于非胁迫时，说明过表达proB、proA基因有助于提高细胞的耐盐性。

  与此同时，与非胁迫条件下相同，过表达proB、proA基因以及glnA基因的缺失均能显著增强细胞合成胞外脯氨酸的能力，在glnA基因缺失的基础上过表达proB基因使得重组菌脯氨酸的合成能力进一步提高。但其胞外脯氨酸含量均较非胁迫时有所下降，这可能与胁迫条件下菌株利用胞外脯氨酸来维持自身生长代谢以应对高渗环境有关。