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枯草芽孢杆菌目的基因的敲除

日期:2018/2/4 17:52:40 点击次数 2284 发布单位:天义生物谷  录入:李清

1 材料和方法


1.1 菌株和质粒


1.2 工具酶与试剂


  本研究所用的Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4连接酶均购于大连宝生物工程有限公司;pMD19-T vector购自TaKaRa公司;试剂新霉素、氨苄青霉素、四环素购自Sigma公司;质粒DNA抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购于北京博大泰克生物有限公司。蛋白胨、酵母粉、琼脂粉购于OXOID公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。


1.3 培养基与培养条件


  LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,固体LB培养基需加入1.5%的琼脂粉。TB发酵培养基(g/L):蛋白胨12.00,酵母粉24.00,K2HPO4 12.54,KH2PO4 2.30,pH 7.0。摇瓶发酵装液量为30 mL/250 mL。在菌株构建和发酵过程中,培养基中添加的氨苄青霉素、新霉素、四环素终浓度分别为100、6、20 mg/L。


1.4 引物


  本研究克隆新霉素基因Neo所用的引物是根据pMA5质粒上新霉素抗性基因序列设计而成,其余所用引物根据GenBank中Bacillus subtilis 168的glnA、proB、proA和P43的基因序列信息设计而成,本实验所用引物的合成及相关测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。


1.5 重组质粒的构


  利用引物proBB-FW & proBE-RV从枯草芽孢杆菌WB600基因组上将编码谷氨酸激酶的proB基因克隆出来,连接到经相同酶切的pHY-P43载体上,构建质粒pHY-P43-proB。利用类似方法构建了重组质粒pHY-P43-proA。


1.6 枯草芽孢杆菌目的基因的敲除


  枯草芽孢杆菌目的基因的敲除采用同源重组的方法。本实验首先利用谷氨酰胺合成酶基因glnA上下游引物glnA-FW和glnA-RV扩增出glnA基因序列,大小为1335 bp。然后将其连接到pMD19-T质粒上,构建质粒pMD19T-glnA。同样的,利用引物NEO-FW和NEO-RV扩增出新霉素抗性基因Neo,并将其连接到pMD19-T载体上,构建质粒pMD19T-Neo。将质粒pMD19T-glnA和pMD19T-Neo均用NcoⅠ和PstⅠ酶进行双酶切,酶切后的新霉素片段连接到经同样酶切的pMD19T-glnA质粒上,构建敲除质粒pMD19T-ΔglnA∷Neo。最后将敲除质粒pMD19T-ΔglnA∷Neo转化进入枯草芽孢杆菌WB600中进行同源重组,在新霉素平板上筛选正确的转化子。敲除质粒的构建如图 2所示。


1.7 重叠片段P43-proB的整合


  首先利用引物P43N-FW和P43N-RV,proBB-FW和proBN-RV分别从枯草芽孢杆菌WB600的基因组上扩增出启动子P43以及谷氨酸激酶基因proB的序列。然后利用引物LJ-P43B和LJ-BP43将二者通过重叠PCR连接成片段P43-proB,并将此片段经Nco Ⅰ单酶切后连接到同样经NcoⅠ单酶切的敲除质粒pMD19T-ΔglnA∷Neo上,构建了重组质粒pMD19T-ΔglnA∷P43-proB-Neo。然后将此重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌WB600中进行同源重组,在新霉素抗性平板上筛选正确的转化子。具体的构建方法见图 2。


1.8 重组菌生长曲线的绘制


  将重组菌接种于20 mL LB液体培养基中,37℃、200 r/min过夜活化。按照初始OD600 0.1的添加量转接于30 mL LB液体培养基中,37℃、200 r/min培养36 h,期间每隔2 h取样1次测定菌体浓度,最后一次取样间隔为4 h。菌体浓度的测定以分光光度计600 nm波长下的吸光值OD600表示。OD600根据下列公式转化为细胞干重:1 OD =0.35 g/L DCW。


1.9 重组菌摇瓶发酵


  将重组菌接种于20 mL LB液体培养基中,37℃、200 r/min活化12 h。按初始OD600 0.1的接种量转接至50 mL的TB培养基中,菌株WB603和WB604初始培养基中添加终浓度为5 mmol/L的谷氨酰胺,37℃、250 r/min摇瓶发酵24 h。发酵结束时取样测量OD600以及发酵液中L-脯氨酸含量,并收集细胞测定胞内游离脯氨酸含量。


1.10 L-脯氨酸的测定


  L-脯氨酸的测定采用酸性茚三酮法。胞外脯氨酸的测定:发酵液12000 r/min离心30 min后,取上清加入等体积10%三氯乙酸沉淀4 h,12000 r/min离心20 min后取上清,稀释适当倍数后测定胞外脯氨酸含量。胞内游离脯氨酸测定:收集菌体,菌体用去离子水洗涤2次,重悬菌体并调整到OD600值为5,加入终浓度为20 mg/L的溶菌酶37℃保温3 h后参照Whatmore AM的方法测定。

 
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